مقاله رایگان درباره اخلاق در پژوهش، گروه کنترل

مورفیسم ها بسیار پیچیده است و ارتباط این پلی مورفیسم برای هر جمعیت قومی میتواند منحصر به فرد باشد پس مطالعه در هر جمعیتی ضروری به نظر میرسد .

همراهی معنی دار ژن p53 با بیماری
تعداد شاهد
تعداد مورد
سال
نام افراد و مطالعه
کدون 248
کدون 72
کدون 11


خیر

153
151
2004
لتوآدا
خیر
بله
خیر
150
148
2006
یوآن شی

بله


38
2009
ریبرو
خیر
خیر
خیر
169
198
2011
بیانکو

بله

330
180

یانگ

بله


204
2012
آرئولا

بله

857
749
2012
شاتینگ جیا

بله

253
151
2012
آرئولا

بله

221
270
2012
پروستلینگ

بله

30
58
2012
اکباس

همراهی معنی دار ژن PAI-1 با بیماری
تعداد شاهد
تعداد مورد
سال
نام افراد و مطالعه
بله
35
39
2003
استلس
بله
14
12
2004
بروس
بله


2005
وون
بله
32
57
2005
رامن
بله
219
170
2008
رامن
خیر
164
204
2009
مارکوئی
بله
43
75
2006
کانادا
خیر
219
170
2008
اسپانیا
خیر
164
204
2009
ایتالیا
بله
148
140
2011
مارکوئی

فصل سوم
مواد و روش ها

3-1 ) افراد مورد مطالعه و جمع آوری نمونه ها :
در این تحقیق به منظور بررسی پلی مورفیسم های دو ژن P53 و PAI- 1 ، نمونه گیری از بین زنان مراجعه کننده به مرکز فوق تخصصی درمان ناباروری و سقط مکرر ابن سینا که در محدوده سنی 23 تا 37 سال بودند انجام گرفت . معیار انتخاب بیماران تشخیص وجود اندومتریوز با کمک لاپاروسکوپی و تست های تشخیصی مکمل بوده است. گروه کنترل از بین سایر مراجعین که تشخیص بیماری اندومتریوزیس برای ایشان محتمل نبوده ، انتخاب می گردیدند . جهت محاسبه تعداد نمونه مورد نیاز از فرمول زیر استفاده شد :

N=

که اگر خطای نوع اول معادل 0.05 و توان مطالعه 80% فرض شود ، لذا تعداد نمونه ها در هر گروه حدود 150 نفر بر آورد شده و بطور کلی 150 نفر در گروه شاهد و 150 نفر در گروه بیمار برای این مطالعه در نظر گرفته شدند .
زنانی که تشخیص قطعی بیماری اندومتریوز در آنها به کمک لاپاروسکوپی داده شده بود به عنوان بیمار انتخاب شدند و 150 خانم بدون بدخیمی های ژینکولوژیک که سالم بودن آنها به کمک لاپاروسکوپی تائید شده بود به عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شدند . معیار خروج از مطالعه کیفیت نامناسب نمونه برای استفاده در آزمون های مولکولی و سابقه بیماری های :
Diabetic ، Giant cell، Rheumatoid arthritis،Behcet disease،Psorasis ، retinopathy
عنوان شد . در ضمن سعی گردید که بیماران و گروه کنترل از نظر سن، قومیت و وضعیت جسمانی تفاوت معناداری نداشته نباشند . به منظور نمونه گیری خون و انجام طرح ، از کمیته اخلاق در پژوهش های پزشکی پژوهشگاه ابن سینا مجوز لازم اخذ گردید و تمام افراد مورد مطالعه رضایت نامه تدوین شده را آگاهانه امضاء نمودند . پس از طی مراحل لازم ،cc 10 خون از هر فرد شرکت کننده در مطالعه در لوله حاوی EDTA گرفته شد.

3-2 ) استخراج DNA
روش های متعددی برای استخراج DNA وجود دارد که از بین آنها روش استخراج DNA بوسیله رسوب نمکی136 انجام شد و غلظت و کیفیت DNA جدا شده با اسپکتروفوتومتر و ژل آگاروز سنجیده شد.

3-2-1 ) مواد ووسایل مورد نیاز :

جدول 2-1 : مواد و وسایل استفاده شده در استخراج

نام ماده یا وسیله
نام شرکت سازنده
1
NaCl
Merck, Germany
2
Na2 EDTA
Plusone, Sweden
3
Tris-HCl
USB, USA
4
HCl
Mojallali Chemical Laboratories, Iran
5
NaOH
Merck, Germany
6
ایزوپروپانول
Merck, Germany
7
SDS
Plusone, Sweden
8
پروتئیناز K
Sigma, USA
9
اتانول
Merck, Germany
10
آب مقطر دو بار تقطیر استریل

11
میکروتیوب1/5 mL
Trefflab, Germany
12
دستگاه سانترفیوژ یخچال دار
Hettich, Germany
13
سمپلر متغیر(0/5 -10 ?L 10-100 ?L)
Eppendorf, Germany
14
دستگاه اسپکتروفتومتر
Picodrop,UK

3-2-2 ) تهیه محلول های مورد نیاز :
برای استخراج DNA به سه بافر A , C , D نیاز داریم که هر یک را طبق فرمول زیر تهیه می گردد .
بافر A ([Tris-EDTA-Salt, pH: 7.5-8] TES ) : ( 10X ) Tris-HCl +Mg +O + Nacl
بافر C : آب مقطر
بافر D ( ( (1x ,pH:8) TE : EDTA + Tris-HCl+ آب مقطر

برای تهیه بافر TES ابتدا محلول های زیر تهیه شدند :
– : (0.5 M, pH: 8) EDTA ابتدا 186.1 گرم پودر EDTA را در 800ml آب مقطر حل کرده و روی همزن مغناطیسی قرار داده شد . پس از حل شدن PH محلول با استفاده از کالیبراسیون و NaOH به 8 رسید ، و در نهایت با آب مقطر محلولی به حجم نهایی یک لیتر تهیه شد . سپس محلول بدست آمده به کمک فیلتر میلی پور 0.2 ?mدر زیر هود فیلتر شده و به حجم های کوچک تقسیم و در یخچال نگهداری شد .
– : (1M, pH: 7.4-8) Tris-HCl 121.14گرم از Tris-HCl را داخل آب مقطر استریل حل کرده و PH محلول با روش کالیبراسیون و HCL تنظیم گردید .
– : (5M) NaCl 292.2 گرم NaCl در 800ml اب مقطر حل شده و حجم نهایی محلول به یک لیتر رسانده شد .

روش تهیه بافر TES :
ابتدا10ml از(1M ) Tris-HCl را با 30ml از(5M) NaCl و 20ml از EDTA (0.5M) را مخلوط کرده و حجم نهایی محلول را با آب مقطر به 100ml رسانده شد . سپس PH محلول را با HCl (1M) بر روی عدد 7.4-8 تنظیم گردید و سپس به کمک فیلتر میلی پور استریل شد .
: (10%) SDS 100 گرم SDS در 900ml آب مقطر حل شده
و تا دمایC ?68 گرم شد . PH محلول با استفاده از HCl به 7.7 و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسید .

روش تهیه بافر TE ( PH=8 ، 1X ) :
مقدار 10ml از (1M) Tris-HCl را با 2ml از EDTA (0.5 M ) مخلوط کرده و حجم نهایی محلول با آب مقطر استریل به 1 لیتر رسانده شد و سپس به کمک فیلتر میلی پور استریل شد .
3-2-3 ) روش کار :
از هر فرد 5ml خون محیطی گرفته و در لوله حاوی 100?l از EDTA ( 0.5 M ) ریخته شد . مراحل ذیل بر نمونه خونی گرفته شده زیر انجام گردید :
1. سانتریفیوز با 1000 rpm به مدت 10 دقیقه .
2. پلاسما را دور ریخته و لایه حاوی گلبول های سفید و گلبول های قرمز باقی می ماند .
3. به مقدار 8-10 ml آب مقطر سرد به مخلوط باقیمانده اضافه شد .
4. سانتریفیوژ مجدد با دور 1000 rpm به مدت 20 دقیقه
5. مایع رویی را دور ریخته و روی رسوب به مقدار 5-6 ml آب مقطر سرد اضافه گردید و خوب تکان داده شد .
6. سانتریفیوژ با دور 1000 rpm به مدت 15 دقیقه
7. مراحل 5 و 6 تکرار شد تا رسوبی صورتی کم رنگ ظاهر گردید .
8. به رسوب فوق مقدار 3000?l از بافر TES اضافه گردید ، خوب تکان داده شد تا کاملا حل شود ، سپس به آن 250 ?l از SDS 10% و 25 ?l از پروتئیناز k (100mg/ml ) اضافه گردید و به آرامی تکان داده شد .
9. انکوباسیون در بن ماری C ?37 در طول شب .
10. مقدار 2ml از NaCl (5M) به لوله آزمایش فوق اضافه گردید و به آرامی تکان داده شد و سپس با دور 1000 rpm به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد ، محلول رویی به لوله جدیدی منتقل شد .
11. مقدار 4ml ایزوپروپرانول به هر لوله اضافه گردید و محلول به آرامی تکان داده شد تا کلاف DNA ظاهر گردید .
12. کلاف DNA به یک میکروتیوپ استریل منتقل گردید و سپس به مدت 10 دقیقه با دور 800 rpm سانتریفیوژ شد .
13. مایع رویی را دور ریخته و روی رسوب حدود 200-500 ?l اتانول 70% اضافه و با مدت یک دقیقه با دور 800 rpm سانترفیوژ شد .
14. مایع رویی را دور ریخته و میکروتیوپ را تا تبخیر مایع باقی مانده در محیط آزمایشگاه نگهداشته ، سپس به آن بافر TE یا با آب مقطر دو بار تقطیر استریل اضافه شد ( حجم بافر TE یا آب مقطر بستگی به مقدار DNA دارد و از 10 ?l تا 200 ?l متغیر می باشد ) . DNA های استخراج شده در دمایC ?20- نگهداری شدند .

3-3 ) بررسی کیفی و کمی DNA استخراج شده
پس از استخراج DNA کمیت و کیفیت آن با کمک اندازه گیری جذب نوری در طول موج 260 nm و نیز الکتروفورز در ژل آگارز بررسی گردید .

3-3-1 ) بررسی کیفی :
برای اطمینان یافتن از کیفیت DNA های استخراج شده و عدم وجود شکستگی در آنها مقدار 2?l از هر نمونه DNA روی ژل آگارز 1% ، مطابق روشی که در ادامه توضیح داده خواهد ، الکتروفورز گردید و با مشاهده الگوی الکتروفورز ، کیفیت DNA استخراج شده مشخص گردید .

شکل 2-1 ) بررسی کیفیت DNA استخراج شده توسط الکتروفورز با ژل آگارز 1%

3-3-2 ) بررسی کمی :
از هر نمونه حجمی برابر با 3?l به داخل سر سمپلر کشیده و سر سمپلر وارد محفظه مخصوص تعبیه شده در دستگاه اسپکتروفتومتر (Picodrop,UK) شد . سپس نوع نمونه مورد بررسی که ds-DNA است برای دستگاه تعریف شد تا اندازه گیری نوری انجام شود . نتیجه به صورت نموداری به نمایش در می آید . از طرف دیگر غلظت DNA بر حسب ng/?l مشخص شد . به منظور تعیین میزان آلودگی DNA با پروتئین و سایر موارد نسبت جذب در طول موج 260 nm به 280 nm به وسیله دستگاه اندازه گیری شد. نسبت حاصله در صورتیکه بین 1.6-1.9 باشد ، مطلوب است ، در غیر اینصورت می توان یکبار دیگر مرحله شستشو با اتانول 70% را انجام داد .

3-4 ) تعیین ژنوتیپ نمونه ها

3-4-1 ) طراحی پرایمرها :
در این بررسی پلی مورفیسم های ژن P53 و PAI-1 مورد ارزیابی قرار گرفته و برای انجام PCR و تشخیص موتاسیون ژن P53 سه جفت پرایمر و برای تشخیص موتاسیون ژن PAI-1 یک جفت پرایمر با توالی های زیر طراحی گردید .

3-4-1-1 ) پرایمر کدون 11 ژن P53 :
Forward : 5′-CTTGGGTTGTGGTGAAACATTG- 3 ´
Reverse : 5′-GTCAGTCCCATGAATTTTCGCT-3´

این پرایمر ها یک توالی نوکلئوتیدی به طول 379 bp را در ناحیه کدون 11 ژن P53 تکثیر می کنند .

3-4-1-2 ) پرایمر کدون 72 ژن P53 :
Forward : 5-´TCCCCCTTGCCGTCCCAA-3´
Reverse : 5´-CGTGCAAGTCACAGACTT-3´

این پرایمرها یک توالی نوکلئوتیدی به طول 279 bp را در ناحیه کدون 72 ژن p53 تکثیر می کنند .

3-4-1-3 ) پرایمر کدون 248 ژن P53 :
Forward : 5´-TAGGTTGGCTCTGACTGTACCA-3´
Reverse : 5´-TGTGATGAGAGGTGGATGGGTA-3´

این پرایمرها یک توالی نوکلئوتیدی به طول 233 bp را در ناحیه کدون 248 ژن p53 تکثیر می کنند .
3-4-1-4 ) پرایمر ژن PAI-1 :
با استفاده از این پرایمرها یک توالی 98 bp را در ناحیه -675 4G/5G تکثیر می کنند .
Forward : 5´-CACAGAGAGAGTCTGGCCACGT-3´
Reverse : 5´-CCAACAGAGGACTCTTGGTCT-3´

3-4-2 ) PCR
برای انجام PCR با توجه به پرایمرهای هر کدون برنامه ای مناسب هر یک طراحی شد .

3-4-2-1 ) PCR ژن P53 کدون 11
ابتدا با توجه به دمای TM پرایمرها گرادیان دمایی گذاشته شد و دمای 60 درجه به عنوان بهترین دمای اتصال انتخاب شد .
مواد و وسایل مورد نیاز :
– (Bioflux ) PCR reaction buffer
– (Bioflux) Taq DNA polymerase
– (Bioflux )
– (Fermentas, EU) dNTPs
– (Bio NEER) Forward primer
– (Bio NEER) Reverse primer
– آب مقطر دو بار تقطیر استریل
– سمپلر متغیر ( Eppendor, Germany)( 1-10 ?l, 10-100 ?l , 100-1000 ?l)
– میکروتیوپ ?l 0.2 عاری از DNAase و RNAase ( (Trefflab,Germany)
– دستگاه ترموسایکلر (Eppendorf mastercycler gradient, Germany )

روش کار :
در میکروتیوپ ml 0.5 ابتدا Master mix تهیه گردید. نوع و نسبت ترکیبات به شرح جدول زیر می باشد :

جدول 2-2 : غلظت و مقدار مواد استفاده شده در PCR کدون 11 ژن P53
غلظت
حجم
مواد
10X
2.5 ?l
10X PCR Buffer
10mM
1 ?l
dNTPs Mix
5 U/ ?l
0.2 ?l< br />Taq DNA Polymerase
10 pmol/ ?l
1 ?l
Forward primer
10 pmol/ ?l
1 ?l
Reverse primer
25 mM
1 ?l


17.3 ?l
DDW

?l 25
حجم نهایی

به هریک از میکروتیوپ های 0.2 میلی لیتری مقدار ?l 24 از Master mix اضافه گردید و سپس به هر میکروتیوپ مقدار ?l 1 از نمونه های DNA استخراج شده مورد نظر با غلظت ?l/ng 50 اضافه شد تا حجم نهایی هر واکنش ?l 25 شود در ضمن در ویال کنترل منفی ?l 1 آب مقطر افزوده شد و بر طبق پروتکل دمایی زیر تکثیر شد .
زمان
دما
2 min
95°c
30 sec
95°c
30 sec
60°c
40 sec
72°c
5 min
72°c

29 cycles

پس از پایان برنامه ، نمونه ها تا زمان بررسی نتیجه PCR روی ژل آگارز 1.5 % در°c 4 نگهداری شدند .

3-4-2-2 ) PCR ژن P53 کدون 72
ابتدا با توجه به دمای TM پرایمرها گرادیان دمایی گذاشته شد و دمای 60 درجه به عنوان بهترین دمای اتصال انتخاب شد .
مواد و وسایل مورد نیاز :
– ( Bioflux) PCR reaction buffer
– (Bioflux ) Taq DNA polymerase
– (Bioflux )
– (Fermentas, EU) dNTPs
– (Bio NEER) Forward primer
– (Bio NEER) Reverse primer
– آب مقطر دو بار تقطیر استریل
– سمپلر متغیر ( Eppendor, Germany)( 1-10 ?l, 10-100 ?l , 100-1000 ?l)
– میکروتیوپ ?l 0.2 عاری از( DNAase و RNAase ( (Trefflab,Germany)
– دستگاه ترموسایکلر (Eppendorf mastercycler gradient, Germany )

روش کار :
در میکروتیوپ ml 0.5 ابتدا Master mix تهیه گردید. نوع و نسبت ترکیبات به شرح جدول زیر می باشد :

جدول 2-3 : غلظت و مقدار مواد استفاده شده در PCR کدون 72 ژن P53
غلظت
حجم
مواد
10X
2.5 ?l
10X PCR Buffer
10mM
1 ?l
dNTPs Mix
5 U/ ?l
0.2 ?l
Taq DNA Polymerase
10 pmol/ ?l
1 ?l
Forward primer
10 pmol/ ?l
1 ?l
Reverse primer
25 mM
2 ?l


16.3 ?l
DDW

?l 25
حجم نهایی

به هریک از میکروتیوپ های 0.2 میلی لیتری مقدار ?l 24 از Master mix اضافه گردید و سپس به هر میکروتیوپ مقدار ?l 1 از نمونه های DNA استخراج شده مورد نظر با غلظت ?l/ng 50 اضافه شد تا حجم نهایی هر واکنش ?l 25 شود در ضمن در ویال کنترل منفی ?l 1 آب مقطر افزوده شد و بر طبق پروتکل دمایی زیر تکثیر شد .
زمان
دما
2 min
95°c
30 sec
95°c
30 sec
60°c
30 sec
72°c
5 min
72°c

29 cycles

پس از پایان برنامه ، نمونه ها تا زمان بررسی نتیجه PCR روی ژل آگارز 1.5 % در°c 4 نگهداری شدند.

3-4-2-3 ) PCR ژن P53 کدون 248
ابتدا با توجه به دمای TM

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *